SLP-1(odkaz:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-}peptide-cas-87805-34-3}.html) je polypeptidový hormón pozostávajúci z 30 aminokyselín. Vďaka hĺbkovému výskumu SLP-1 sa vyvinulo stále viac syntetických metód. Tento článok systematicky predstaví v súčasnosti známe metódy syntézy SLP-1.
Metóda 1, syntéza na pevnej fáze:
Syntéza na pevnej fáze je široko používaná metóda syntézy peptidov a proteínov a bežne sa používa aj na syntézu GLP-1. Pri syntéze v tuhej fáze sa jadrová štruktúra vytvorí spojením prvej aminokyseliny so živicou. Potom sa postupne pridá ďalšia aminokyselina a chemicky sa nechá reagovať s vhodným kondenzačným činidlom. Nakoniec je možné cieľový produkt získať odštiepením polypeptidu zo živice.
Význam syntézy v tuhej fáze je v tom, že umožňuje automatizáciu a produkciu syntézy peptidov vo veľkom meradle. Súčasné hlavné metódy syntézy na pevnej fáze zahŕňajú Fmoc a Boc. Medzi nimi metóda Fmoc používa ochrannú skupinu N-Fmoc na ochranu peptidu, zatiaľ čo metóda Boc používa terc-butyloxykarbonyl na ochranu karboxylovej skupiny.
Metóda dva, syntéza v kvapalnej fáze:
Syntéza v kvapalnej fáze je tradičná metóda syntézy peptidov, pri ktorej sú reaktanty umiestnené v kvapalnej fáze na reakciu. Výhodou syntézy v kvapalnej fáze je, že reakčné podmienky sú mierne a vhodné na modifikáciu citlivých chemických štruktúr. Avšak kvôli príliš veľkému množstvu reaktantov je proces čistenia pomerne ťažkopádny. Chemické reakcie v syntéze v kvapalnej fáze zahŕňajú:
1. Kondenzačná reakcia:
Kondenzačná reakcia je jednou z najzákladnejších reakcií v syntéze peptidov, to znamená, že karboxylová skupina iniciovaná kondenzačnými činidlami, ako sú DCC a HOBt, je pripojená k aminoskupine aminokyseliny prostredníctvom acylačnej reakcie. Reakčné podmienky sú mierne a výťažok je vysoký.
2. Eliminačné reakcie:
Eliminačná reakcia spočíva v redukcii metionínu na ditiol pomocou NaBH4 a iných redukčných činidiel, čím sa stáva neaktívnym. Reakcia musí prebiehať za zásaditých podmienok.
3. Odstránenie ochranných skupín:
Kvôli rôznym funkciám aminokyselín v peptidovom reťazci sa na ochranu použijú rôzne ochranné skupiny. Po dokončení syntézy je potrebné odstrániť ochrannú skupinu. Pri metóde Fmoc sa na odstránenie Fmoc zvyčajne používa piperidín; zatiaľ čo pre metódu Boc sa na odstránenie Boc používa TFA.
Metóda tri, chemická syntéza:
GLP-1 je polypeptidový hormón s dôležitými biologickými aktivitami. Jeho syntéza sa môže realizovať rôznymi metódami, medzi ktorými je chemická syntéza jednou z najčastejšie používaných metód. Výhodou chemickej syntézy je, že dokáže produkovať vysoko čisté cieľové produkty, ktoré sú vhodné pre veľkosériovú výrobu. Metóda chemickej syntézy a podrobné kroky SLP-1 budú predstavené nižšie.
1. Syntetická cesta a výber ochranných skupín:
Molekula GLP-1 pozostáva z 36 aminokyselín vrátane 21 aminokyselín typu L a 15 aminokyselín typu D. Pred uskutočnením syntézy je potrebné vybrať vhodnú cestu syntézy a vybrať zodpovedajúcu ochrannú skupinu podľa podmienok syntézy. Syntéza Fmoc na pevnej fáze sa zvyčajne používa na automatizovanú syntézu vo veľkom meradle. Táto metóda používa N-9-fluórimidokarboxylovú ochranu (N-Fmoc) ako ochrannú skupinu a tiež potrebuje vybrať vhodnú sekundárnu ochrannú skupinu (ako je terc-butyl alebo metyl), aby sa zabezpečila ochrana špecifických miest. Zakaždým, keď sa pridá nová aminokyselina, je potrebné najprv odstrániť ochrannú skupinu Fmoc a potom sa pridá chránená kopulačná látka ďalšej aminokyseliny.
2. Syntéza základnej aminokyselinovej sekvencie:
Hlavná sekvencia GLP-1 pozostáva z 21 aminokyselín vrátane kľúčového serínu a štyroch dipeptidových sekvencií kyseliny prolyl-glutámovej. Pri syntéze na pevnej fáze možno syntézu hlavnej sekvencie rozdeliť do nasledujúcich krokov:
2.1. Pridajte karbamát kyseliny octovej (Fmoc-NH-CH2CO2Et) a 2-Cl-Trt-Cl k syntetickej živici na pevnej fáze a vykonajte kondenzačnú reakciu s DIC/NMM kopulačným činidlom.
2.2. Odstrániť Fmoc chrániacu skupinu reakciou deprotekčnej skupiny.
2.3. Pridajte ďalšiu aminokyselinu, opakujte krok 1 a krok 2 v poradí, kým sa nesyntetizuje základná sekvencia.
2.4. Tvorba pentapeptidových štruktúr na pevnej fáze živice. Pridajte acetalizačné činidlo k živici na pevnej fáze, reagujte s N-koncovým rozpoznávacím činidlom (ako je HBTU), pridajte chrániacu skupinu serínu na bočnom reťazci ako pomocné redukčné činidlo a potom odstráňte chrániacu skupinu Fmoc.
2.5. Za katalýzy Bacillus subtilis transferázy (ProTide) prechádza pentapeptidová štruktúra výmennou reakciou s prekurzorom serínjódacetátu.
3. Syntéza zostávajúcej aminokyselinovej sekvencie:
Po dokončení syntézy základnej sekvencie je potrebné pokračovať v pridávaní zostávajúcich aminokyselín, vrátane aminokyselín typu L a D. Pridávanie týchto aminokyselín musí začať od základnej sekvencie, pridať ďalšiu aminokyselinu v poradí a použiť zodpovedajúce kondenzačné činidlo na uskutočnenie chemických reakcií, kým sa nesyntetizuje kompletná molekula GLP-1 polypeptidu. Počas tohto procesu je tiež potrebné zvoliť vhodnú ochrannú skupinu podľa potreby a uskutočniť kroky reakcie, odstránenia ochrannej skupiny a pridania aminokyseliny postupne.
4. Úprava hydroxidom sodným:
Po pridaní všetkých aminokyselín sa na živici v tuhej fáze vytvorí neúplne syntetizovaný peptidový reťazec, ktorý je potrebné spracovať, aby sa vytvorila úplne vytvorená molekula peptidu. Po prvé, nesformovaný peptid by mal byť hydrolyzovaný hydroxidom sodným, takže C-koncová karboxylová skupina pôvodne pripojená k živici sa oddelí od živice a ochranná skupina sa oddelí vo vode. Po hydrolytickej reakcii sa získa cieľový produkt.
5. Zrážanie a pranie:
Po spracovaní sa hydrolyzovaný roztok spracuje kyselinou, aby sa vyzrážal cieľový produkt. Potom sa peleta resuspendovala vo vode, po čom nasledovalo intenzívne premytie, aby sa odstránili nečistoty.
6. Čistenie:
Posledným krokom je purifikácia požadovaného produktu, zvyčajne použitím vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Počas tohto procesu je možné určiť čistotu produktu detekciou píku roztoku v hmotnostnom spektre. Stručne povedané, chemická syntéza GLP-1 vyžaduje niekoľko kôl zložitých reakcií a prísne purifikačné procesy, aby sa nakoniec získal aktívny cieľový produkt.
Metóda štyri, biosyntéza:
GLP-1 je dôležitý polypeptidový hormón s rôznymi fyziologickými účinkami vrátane podpory sekrécie inzulínu, potláčania chuti do jedla, znižovania telesnej hmotnosti a udržiavania citlivosti na inzulín atď. Metóda biosyntézy GLP-1 je syntetizovaná hlavne L bunkami v pankreatickej žľaze a rýchlosť jeho syntézy je regulovaná príjmom potravy. Podrobné kroky sú uvedené takto:
1. Prípravné práce pred syntézou:
Pred biosyntézou GLP-1 je potrebné vykonať niekoľko prípravných prác vrátane určenia typu použitých buniek, nastavenia kultivačných podmienok a výberu vhodného katalytického enzýmu. L bunky sú hlavným zdrojom syntézy GLP-1, pretože obsahujú prekurzory dvoch hormónov, GIP (glukagónu podobný peptid 1) a GLP-1. L bunky môžu byť izolované z črevného epitelu králikov alebo myší. Pred biosyntézou je potrebné bunky kultivovať v dostatočnom počte a zabezpečiť dostatok živín a vhodné kultivačné podmienky. Okrem toho je potrebné zvoliť vhodný katalytický enzým na podporu reakcie.
2. Syntéza a spracovanie prekurzorov:
Biosyntéza GLP-1 sa vyskytuje hlavne v L bunkách a jej prekurzor sa skladá z dvoch hormónov, GIP a GLP-1. Po vstupe do endokrinných buniek sú GIP a GLP-1 spracované proteolytickými enzýmami a štiepené na jednotlivé peptidy. Do tohto procesu je zapojená séria enzýmov a kofaktorov, vrátane prekurzorovej polypeptidovej acidázy (PC2), izomerázy a faktorov neskorej adhézie.
3. Vzájomná konverzia medzi polypeptidovými segmentmi:
Po spracovaní sa GIP a GLP-1 peptidy rekombinujú za vzniku GLP-1 polypeptidu. Tento proces vyžaduje použitie glukagónu podobného peptidu 1 (GLP-1) ako templátu, ku ktorému sa kombinujú ďalšie jednotlivé peptidy za vzniku nových zložených polypeptidov. Tento proces tiež vyžaduje niektoré špecifické enzýmy a faktory, vrátane prohormónovej konvertázy 1/3 (PC1/3) a karboxypeptidázy E (CPE).
4. GLP-1 sekrécia:
Potom, čo je GLP-1 syntetizovaný a spracovaný, je uložený v cytoplazme a vnútorných vezikulách endokrinných buniek. Keď sú endokrinné bunky stimulované stravou, uvoľňujú GLP-1 a vstupujú do krvného obehu prostredníctvom mikrociev. Tento proces je regulovaný a riadený sériou signálnych transdukčných dráh, vrátane cAMP-Ca2 plusa tak ďalej.
Stručne povedané, biosyntéza SLP-1 zahŕňa spoločné pôsobenie viacerých väzieb a faktorov. Kombinácia biosyntézy a chemickej syntézy môže poskytnúť lepší základ a podporu pre výskum a výrobu SLP-1.
Metóda 5, enzymatická syntéza:
Enzymatická syntéza je syntéza peptidových reťazcov prostredníctvom katalýzy biologických enzýmov. V porovnaní s tradičnými metódami syntézy v kvapalnej fáze sa enzymatická syntéza môže uskutočňovať pri teplote miestnosti a je možné vybrať širokú škálu surovín. Na katalýzu syntézy sa zvyčajne používajú enzýmy, ako je theta-kvapalná syntáza, AEP, ACE atď.
Na záver, vyššie uvedené metódy sú uskutočniteľnými metódami syntézy SLP-1. Rôzne metódy sú vhodné pre rôzne experimentálne podmienky a prostredia farmaceutickej výroby.