Joj, kolegovia proteínoví nadšenci! Dnes sa s nadšením ponorím do horúcej témy vo svete produkcie rekombinantných proteínov: ako množstvoIPTG prášokpoužitý môže totálne ovplyvniť výťažok týchto ach - tak - cenných rekombinantných proteínov. Ako dodávateľ prášku IPTG som na vlastnej koži videl, ako tento malý prášok môže spôsobiť alebo zlomiť vašu hru na produkciu bielkovín.
Najprv si rýchlo prejdime, čo je IPTG. IPTG alebo izopropyl β-D-1-tiogalaktopyranozid je dobre známa chemická zlúčenina, ktorá sa používa ako induktor pri výrobe rekombinantných proteínov. Napodobňuje prirodzený induktor alolaktózy a viaže sa na lac represor, ktorý potom umožňuje transkripciu cieľového génu. Zjednodušene povedané, je to ako kľúč, ktorý odomkne dvere pre vaše baktérie, aby začali chrliť rekombinantný proteín, po ktorom túžite.
Poďme sa teda porozprávať o vzťahu medzi množstvom prášku IPTG a výťažkom rekombinantného proteínu. Vo všeobecnosti si možno myslíte, že viac IPTG znamená viac bielkovín. Ale nie je to také jednoduché. Je to niečo ako pečenie koláča. Pridaním príliš veľkého množstva cukru nie je koláč vždy lepší; v skutočnosti to môže pokaziť.
Nízke hladiny IPTG
Keď použijete malé množstvo prášku IPTG, indukcia produkcie rekombinantného proteínu je trochu pomalšia. Lac represor nie je úplne inhibovaný, takže v danom čase sa prepisuje len malý počet génov. To môže viesť k nižšiemu celkovému výťažku rekombinantného proteínu. Ale sú tu nejaké výhody. Po prvé, baktérie sú menej stresované. Predstavte si to ako baktérie, ktoré majú jednoduché pracovné prostredie. Môžu pomaly a stabilne produkovať proteín a často je pravdepodobnejšie, že proteín bude v správnej, zloženej forme. Toto je veľmi dôležité, ak hľadáte funkčný proteín.
Nevýhodou však je, že výrobný proces trvá dlhšie. Ak sa ponáhľate, aby ste získali veľké množstvo rekombinantného proteínu, nízka úroveň indukcie IPTG nemusí byť vašou najlepšou voľbou. Napríklad, ak pracujete na časovo citlivom výskumnom projekte, kde potrebujete dokončiť niekoľko kôl experimentov so slušným množstvom bielkovín, čakanie na dlhý čas, kým sa bielkoviny nahromadia, vám to jednoducho nezostanú.
Vysoká úroveň IPTG
Na druhej strane, použitie vysokého množstva IPTG vám môže poskytnúť rýchly začiatok produkcie bielkovín. Lac represor je úplne preplnený a naraz sa prepíše veľké množstvo génov. To často vedie k rýchlemu zvýšeniu produkcie rekombinantných proteínov a môžete získať vyšší výťažok za kratšiu dobu. Je to ako dať baktériám poriadne zabrať, aby začali pracovať nadčas.
Ale tu je háčik. Vysoké hladiny IPTG môžu byť pre baktérie toxické. Môže ich to natoľko vystresovať, že začnú odumierať alebo sa stanú menej efektívne pri produkcii proteínu. Proteín sa tiež nemusí správne zložiť. Keď sú baktérie bombardované vysokým dopytom po produkcii proteínu, nemusia mať dostatok času alebo zdrojov na jeho správne zloženie. To môže viesť k tvorbe inklúznych teliesok,
čo sú agregáty nesprávne poskladaných proteínov. S týmito inklúznymi telieskami je ťažké sa vysporiadať, pretože potom musíte prejsť zložitým procesom na solubilizáciu a opätovné poskladanie proteínu.
Nájdenie sladkého miesta
Ako teda nájdete správne množstvo prášku IPTG na použitie? No záleží to od množstva faktorov. Typ baktérií, ktoré používate, je veľký. Rôzne kmene baktérií majú rôznu citlivosť na IPTG. Niektoré zvládnu vyššiu dávku bez toho, aby sa príliš stresovali, zatiaľ čo iné sú jemnejšie.
Dôležité sú aj podmienky rastu baktérií. Veci ako teplota, typ média a hladiny kyslíka môžu ovplyvniť, ako baktérie reagujú na IPTG. Napríklad, ak baktérie rastú v bohatom médiu, môžu byť odolnejšie voči účinkom vysokoúrovňového IPTG.
Ďalšia vec, ktorú treba zvážiť, je povaha samotného rekombinantného proteínu. Ak je proteín veľmi zložitý alebo má veľa disulfidových väzieb, možno budete chcieť použiť nižšie množstvo IPTG, aby ste baktériám poskytli viac času na správne poskladanie.
Ako dodávateľ prášku IPTG som často požiadaný o odporúčania týkajúce sa množstva, ktoré sa má použiť. A moja odpoveď je vždy: "Záleží." Môžem však ponúknuť niekoľko všeobecných pokynov. Dobrým miestom na začiatok je rozsah koncentrácie 0,1 - 1 mM IPTG. Potom môžete vykonať niekoľko malých experimentov, aby ste videli, ako váš konkrétny systém reaguje. Vyskúšajte rôzne koncentrácie v tomto rozsahu a zmerajte výťažok a kvalitu bielkovín.
Teraz sa pozrime na príklady zo skutočného sveta. Vo výskumnom projekte, kde sa vedci pokúšali vyrobiť špecifický enzým, spočiatku používali nízku koncentráciu IPTG (0,1 mM). Výťažok proteínu bol relatívne nízky, ale enzým bol vysoko aktívny, čo naznačuje, že bol dobre zložený. Keď zvýšili koncentráciu IPTG na 1 mM, výťažok sa zvýšil, ale aktivita enzýmu sa znížila. Ďalšia analýza ukázala, že pri vyššej koncentrácii bolo viac inklúznych teliesok.
V inom prípade biotechnologická spoločnosť vyrábala terapeutický proteín. Zistili, že starostlivou optimalizáciou koncentrácie IPTG na základe rastovej fázy baktérií boli schopní dosiahnuť vysoký výťažok správne poskladaného proteínu. To im nielen ušetrilo čas, ale aj znížilo náklady na následné spracovanie.
Ak hľadáte vysoko kvalitný prášok IPTG, máme pre vás pokrytie. Náš IPTG prášok je čistý a spoľahlivý, čo zaručuje konzistentné výsledky vo vašej produkcii rekombinantných proteínov. A keď už ste tu, pozrite si niektoré z našich ďalších skvelých produktov. Na našej webovej stránke nájdete čistý sevofluran CAS 28523 - 86 - 6, prášok apigenínu CAS 520 - 36 - 5 a prášok kyseliny ellagovej CAS 476 - 66 - 4.
Ak máte akékoľvek otázky týkajúce sa množstva prášku IPTG, ktorý sa má použiť pre váš konkrétny projekt, alebo ak máte záujem o kúpu našich produktov, neváhajte nás kontaktovať. Vždy sme tu, aby sme vám pomohli optimalizovať produkciu rekombinantných bielkovín. Spolupracujme na dosiahnutí najlepších výsledkov pre vaše potreby výskumu alebo výroby!
Referencie
- Sambrook, J. a Russell, DW (2001). Molekulárne klonovanie: Laboratórna príručka. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Studier, FW, & Moffatt, BA (1986). Použitie bakteriofágovej T7 RNA polymerázy na riadenie selektívnej vysokoúrovňovej expresie klonovaných génov. Journal of Molecular Biology, 189(1), 113 - 130.
- Baneyx, F. (1999). Expresia rekombinantného proteínu v Escherichia coli. Biotechnology and Applied Biochemistry, 30 (Pt 2), 101 - 106.